鎳-NTA瓊脂糖凝膠6FF
作者：技術(shù) 來(lái)源：北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司 2024-11-07 瀏覽量：9
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不同的樣品，吸附和洗脫方法不相同，可以根據(jù)相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行。
1 簡(jiǎn)介
金屬螯合親和層析介質(zhì)，又稱固定金屬離子親和色譜，其原理是利用蛋白質(zhì)表面的一些氨基酸，如組氨酸能與多種過(guò)渡金屬離子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，F(xiàn)e3+發(fā)生特殊的相互作用，能夠吸附富含這類氨基酸的蛋白質(zhì)，從而達(dá)到分離純化的目的。因此，偶聯(lián)這些金屬離子的瓊脂糖凝膠就能夠選擇性地分離出這些含有多個(gè)組氨酸的蛋白以及對(duì)金屬離子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。一般來(lái)說(shuō)，Ni2+是用于純化組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)的優(yōu)選金屬離子。半胱氨酸和色氨酸也能與固定金屬離子結(jié)合，但這種結(jié)合力要遠(yuǎn)小于組氨酸殘基與金屬離子的結(jié)合力。
鎳親和層析介質(zhì)具有特異性好、流速快的優(yōu)點(diǎn)，非常適合放大生產(chǎn)。
2 性能參數(shù)：
*檢測(cè)條件： 層析柱16mm×200mm *柱床高5cm，25℃
3 使用方法
Ni NTA瓊脂糖凝膠6FF預(yù)先偶聯(lián)Ni2+離子。通常，Ni2+是用于純化重組組氨酸標(biāo)簽蛋白的優(yōu)選金屬離子，用咪唑進(jìn)行洗脫。
我們建議在含0.5-1.0 M NaCl的緩沖液，中性至弱堿性pH 7-8，這樣的條件下結(jié)合，經(jīng)常使用磷酸鈉緩沖液。也可以使用Tris-HCl，但是在金屬-蛋白質(zhì)親和力非常弱的情況下應(yīng)該避免，因?yàn)樗梢越档徒Y(jié)合強(qiáng)度，在緩沖液中避免螯合劑如EDTA或檸檬酸鹽的存在。
如果重組組氨酸標(biāo)簽蛋白表達(dá)為包涵體，則在所有緩沖液中包括高達(dá)6M Gua-HCl或8M尿素。當(dāng)使用高濃度的尿素或Gua-HCl時(shí)，通常發(fā)生蛋白質(zhì)解折疊。包涵體變性復(fù)性是個(gè)很復(fù)雜的過(guò)程，一般的建議純化可溶蛋白。
提示：含有尿素的樣品可以通過(guò)SDS-PAGE直接分析，而含有Gua-HCl的樣品在SDS-PAGE之前必須用尿素緩沖液置換緩沖液。
3.1 緩沖液制備
用于緩沖液制備的水和化學(xué)品應(yīng)具有高純度。使用前通過(guò)0.45μm過(guò)濾器過(guò)濾緩沖液。 使用高純度咪唑，因?yàn)檫@將在280nm處產(chǎn)生非常低的吸光度或沒(méi)有吸光度。
推薦緩沖液
結(jié)合緩沖液：20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，20-40mM咪唑，pH 7.4（最佳咪唑濃度是依蛋白質(zhì)性質(zhì)而定的，20-40mM適用于許多蛋白質(zhì)）。
洗脫緩沖液：20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，500mM咪唑，pH 7.4（洗脫所需的咪唑濃度是依蛋白質(zhì)性質(zhì)而定的）。
3.2裝柱
（1）讓所有的材料和試劑達(dá)到室溫。配制初始緩沖液（平衡液）和洗脫緩沖液。
（2）根據(jù)柱子大小取所需量的凝膠，用去離子水清洗掉20%乙醇，用初始緩沖液（按凝膠：緩沖液=3：1的比例）配成勻漿。
（3）將柱內(nèi)及柱子底端用水或緩沖液潤(rùn)濕并保持一小段液位，務(wù)必使底端無(wú)氣泡。
（4）用玻璃棒引導(dǎo)勻漿沿著柱內(nèi)壁一次性倒入柱內(nèi)，注意勿使產(chǎn)生氣泡。打開(kāi)柱子出液口，使凝膠在柱內(nèi)自由沉降，連結(jié)好柱子頂端柱頭。
（5）打開(kāi)蠕動(dòng)泵，讓緩沖液用使用時(shí)流速的1.33倍的流速流過(guò)，使柱床穩(wěn)定（注意壓力不要超過(guò)填料最大耐壓）。
3.3 樣品的制備
樣品應(yīng)完全溶解。為了避免堵塞層析柱，我們建議通過(guò)0.45μm過(guò)濾器進(jìn)行離心和過(guò)濾，以去除細(xì)胞碎片或其他顆粒物質(zhì)。
3.4 平衡色譜柱
用5-10個(gè)柱體積的結(jié)合緩沖液平衡該柱，直到流出液電導(dǎo)和pH不變。
3.5 上樣
（1）樣品用平衡液配制，樣品一定要離心或過(guò)濾后上樣。鹽濃度太大的樣品需要處理后再配。
（2）一般情況是讓目標(biāo)產(chǎn)品結(jié)合在柱子上，用平衡液洗去雜質(zhì)和沒(méi)有結(jié)合的蛋白，再選擇一種洗脫液洗下目標(biāo)產(chǎn)品。
3.6 洗脫
用洗脫緩沖液使用階梯梯度或線性梯度洗脫。對(duì)于洗脫步驟，5個(gè)柱體積的洗脫緩沖液通常就足夠了。對(duì)于線性梯度洗脫，適當(dāng)增加洗脫步驟。
注意：當(dāng)手動(dòng)測(cè)量吸光度時(shí)，使用洗脫緩沖液作為空白。 如果需要從蛋白質(zhì)中去除咪唑，使用脫鹽柱或透析手段。
3.7 手動(dòng)操作
1) 輕輕搖動(dòng)裝有Ni-瓊脂糖凝膠6FF的瓶子，直到介質(zhì)均勻。
2) 從瓶中取出2ml漿液，并轉(zhuǎn)移到離心管中。
3) 3.500×g離心5分鐘沉淀Ni-瓊脂糖凝膠6FF。
4) 棄去上清液，并換成5ml蒸餾水。
5) 輕輕搖動(dòng)Ni-瓊脂糖凝膠6FF，3分鐘，并通過(guò)在500×g離心5分鐘來(lái)分離。
6) 使用結(jié)合緩沖液代替蒸餾水重復(fù)步驟4和5，至少3-5次。
7) 將Ni-瓊脂糖凝膠6FF轉(zhuǎn)移到量筒。
8) 加入適當(dāng)體積的結(jié)合緩沖液以制備50％漿液。
9) 將4ml樣品加入1ml 50％漿液中。Ni-瓊脂糖凝膠6FF的結(jié)合能力是依據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)不同而不同的，平均值為20-40mg/ml。這意味著1ml的50％漿液可以結(jié)合大約10-20mg組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
10) 將樣品和Ni-瓊脂糖凝膠6FF漿液在室溫下在搖床上低速孵育1小時(shí)。
11) 用2×1ml結(jié)合緩沖液洗滌并收集兩種組分。
12) 用4×0.5ml洗脫緩沖液洗脫，并將洗脫的組分收集在四個(gè)單獨(dú)的管中。
13) 使用分光光度計(jì)測(cè)量280nm處的吸光度，并通過(guò)SDS-PAGE確認(rèn)各組分的純度。使用洗脫緩沖液作為空白。
4. 可能的問(wèn)題
4.1 柱子堵塞
（1）樣品中的細(xì)胞碎片可能堵塞色譜柱。
（2）通過(guò)0.22μm或0.45μm過(guò)濾器離心和/或過(guò)濾樣品。
4.2 洗脫液中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)組氨酸標(biāo)簽蛋白
（1）洗脫條件太溫和（組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)仍然結(jié)合）：用增加咪唑的濃度或降低pH洗脫以確定最佳洗脫條件。
（2）樣品或結(jié)合緩沖液中咪唑的濃度太高，影響了his蛋白質(zhì)的結(jié)合，這時(shí)，需要降低樣品或結(jié)合緩沖液中咪唑濃度。
（3）靶蛋白可能不是預(yù)期的組氨酸標(biāo)簽蛋白：驗(yàn)證DNA序列。
（4）組氨酸標(biāo)簽可能未充分暴露，所以沒(méi)有結(jié)合到填料上。
（5）對(duì)于包涵體，在蛋白質(zhì)的變形復(fù)性過(guò)程中，活性喪失。盡量選擇可溶性蛋白進(jìn)行純化。
（6）緩沖液或樣品組成不正確：檢查樣品和結(jié)合緩沖液的pH和組成，確保溶液中螯合劑或強(qiáng)還原劑以及咪唑的濃度不要太高。
4.3 洗脫的蛋白質(zhì)不純
如果雜蛋白對(duì)鎳離子同樣具有高親和力，這時(shí)需要優(yōu)化結(jié)合緩沖液的咪唑濃度，如果優(yōu)化條件除不去雜蛋白，可能需要通過(guò)離子交換層析或凝膠過(guò)濾進(jìn)一步純化。
5 再生
注意：如果要純化相同的蛋白質(zhì)，則不必在每次純化之間去再生，在5-7次純化后再生就足夠了。
為了重新對(duì)Ni-瓊脂糖凝膠6FF掛Ni2+，首先除去殘留的Ni2+：
（1）用20mM磷酸緩沖液，0.5M NaCl，50mM EDTA，pH 7.4，沖洗柱子，洗5個(gè)柱體積，以洗去殘留的Ni2+離子；
（2）用至少5倍柱體積的蒸餾水洗柱子，以徹底清洗掉殘留的EDTA；
（3）用0.1M NiSO4過(guò)柱子，2-5個(gè)柱體積；
（4）用至少5倍柱體積的蒸餾水洗柱子，以徹底清洗沒(méi)有結(jié)合的Ni2+離子；
（5）用20%的乙醇過(guò)柱子，讓填料保存在20%的乙醇環(huán)境中。
6 在位清洗（CIP）
（1）當(dāng)看到背壓增加時(shí)，就應(yīng)該清洗色譜柱，對(duì)柱子重新掛鎳再生。
（2）除去離子交換作用吸附的蛋白，用2~3倍柱床體積2M NaCl溶液淋洗柱子，再反向淋洗，最后用水徹底清洗。
7 保存
使用完的填料，用純水徹底沖洗，最后保存在20%乙醇中，4℃保存。
注意事項(xiàng)：
1.上樣之前，樣品必須經(jīng)過(guò)膜過(guò)濾及去除色素，否則雜質(zhì)及色素會(huì)被吸附到填料上，影響填料的正常使用。
2.在使用過(guò)程中，避免使用高濃度的強(qiáng)酸強(qiáng)堿，酸和堿的濃度應(yīng)低于0.1摩爾。堿會(huì)使流速變慢。
3.不同的樣品，吸附和洗脫方法不相同，可以根據(jù)相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行。
金屬螯合親和層析介質(zhì)，又稱固定金屬離子親和色譜，其原理是利用蛋白質(zhì)表面的一些氨基酸，如組氨酸能與多種過(guò)渡金屬離子如Cu2+，Zn2+，Ni2+，Co2+，F(xiàn)e3+發(fā)生特殊的相互作用，能夠吸附富含這類氨基酸的蛋白質(zhì)，從而達(dá)到分離純化的目的。因此，偶聯(lián)這些金屬離子的瓊脂糖凝膠就能夠選擇性地分離出這些含有多個(gè)組氨酸的蛋白以及對(duì)金屬離子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。一般來(lái)說(shuō)，Ni2+是用于純化組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)的優(yōu)選金屬離子。半胱氨酸和色氨酸也能與固定金屬離子結(jié)合，但這種結(jié)合力要遠(yuǎn)小于組氨酸殘基與金屬離子的結(jié)合力。
鎳親和層析介質(zhì)具有特異性好、流速快的優(yōu)點(diǎn)，非常適合放大生產(chǎn)。
2 性能參數(shù)：
| 基質(zhì) | 6%的交聯(lián)瓊脂糖凝膠 |
| 配體 | Ni2+ |
| 配體密度 | 10-15μmol /ml |
| 吸附載量 | 20-40mg his標(biāo)簽蛋白/ml填料 |
| 介質(zhì)顆粒大小 | 45-165μm |
| 最大流速 | 300cm/h |
| pH范圍 | 3-10，在位清洗時(shí)pH范圍可到2-11 |
| 化學(xué)穩(wěn)定性 | 0.01 M HCl，0.1 M NaOH |
| 保存溫度 | +4-8℃ |
| 保存液體 | 20%乙醇 |
3 使用方法
Ni NTA瓊脂糖凝膠6FF預(yù)先偶聯(lián)Ni2+離子。通常，Ni2+是用于純化重組組氨酸標(biāo)簽蛋白的優(yōu)選金屬離子，用咪唑進(jìn)行洗脫。
我們建議在含0.5-1.0 M NaCl的緩沖液，中性至弱堿性pH 7-8，這樣的條件下結(jié)合，經(jīng)常使用磷酸鈉緩沖液。也可以使用Tris-HCl，但是在金屬-蛋白質(zhì)親和力非常弱的情況下應(yīng)該避免，因?yàn)樗梢越档徒Y(jié)合強(qiáng)度，在緩沖液中避免螯合劑如EDTA或檸檬酸鹽的存在。
如果重組組氨酸標(biāo)簽蛋白表達(dá)為包涵體，則在所有緩沖液中包括高達(dá)6M Gua-HCl或8M尿素。當(dāng)使用高濃度的尿素或Gua-HCl時(shí)，通常發(fā)生蛋白質(zhì)解折疊。包涵體變性復(fù)性是個(gè)很復(fù)雜的過(guò)程，一般的建議純化可溶蛋白。
提示：含有尿素的樣品可以通過(guò)SDS-PAGE直接分析，而含有Gua-HCl的樣品在SDS-PAGE之前必須用尿素緩沖液置換緩沖液。
3.1 緩沖液制備
用于緩沖液制備的水和化學(xué)品應(yīng)具有高純度。使用前通過(guò)0.45μm過(guò)濾器過(guò)濾緩沖液。 使用高純度咪唑，因?yàn)檫@將在280nm處產(chǎn)生非常低的吸光度或沒(méi)有吸光度。
推薦緩沖液
結(jié)合緩沖液：20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，20-40mM咪唑，pH 7.4（最佳咪唑濃度是依蛋白質(zhì)性質(zhì)而定的，20-40mM適用于許多蛋白質(zhì)）。
洗脫緩沖液：20mM磷酸鈉，0.5M NaCl，500mM咪唑，pH 7.4（洗脫所需的咪唑濃度是依蛋白質(zhì)性質(zhì)而定的）。
3.2裝柱
（1）讓所有的材料和試劑達(dá)到室溫。配制初始緩沖液（平衡液）和洗脫緩沖液。
（2）根據(jù)柱子大小取所需量的凝膠，用去離子水清洗掉20%乙醇，用初始緩沖液（按凝膠：緩沖液=3：1的比例）配成勻漿。
（3）將柱內(nèi)及柱子底端用水或緩沖液潤(rùn)濕并保持一小段液位，務(wù)必使底端無(wú)氣泡。
（4）用玻璃棒引導(dǎo)勻漿沿著柱內(nèi)壁一次性倒入柱內(nèi)，注意勿使產(chǎn)生氣泡。打開(kāi)柱子出液口，使凝膠在柱內(nèi)自由沉降，連結(jié)好柱子頂端柱頭。
（5）打開(kāi)蠕動(dòng)泵，讓緩沖液用使用時(shí)流速的1.33倍的流速流過(guò)，使柱床穩(wěn)定（注意壓力不要超過(guò)填料最大耐壓）。
3.3 樣品的制備
樣品應(yīng)完全溶解。為了避免堵塞層析柱，我們建議通過(guò)0.45μm過(guò)濾器進(jìn)行離心和過(guò)濾，以去除細(xì)胞碎片或其他顆粒物質(zhì)。
3.4 平衡色譜柱
用5-10個(gè)柱體積的結(jié)合緩沖液平衡該柱，直到流出液電導(dǎo)和pH不變。
3.5 上樣
（1）樣品用平衡液配制，樣品一定要離心或過(guò)濾后上樣。鹽濃度太大的樣品需要處理后再配。
（2）一般情況是讓目標(biāo)產(chǎn)品結(jié)合在柱子上，用平衡液洗去雜質(zhì)和沒(méi)有結(jié)合的蛋白，再選擇一種洗脫液洗下目標(biāo)產(chǎn)品。
3.6 洗脫
用洗脫緩沖液使用階梯梯度或線性梯度洗脫。對(duì)于洗脫步驟，5個(gè)柱體積的洗脫緩沖液通常就足夠了。對(duì)于線性梯度洗脫，適當(dāng)增加洗脫步驟。
注意：當(dāng)手動(dòng)測(cè)量吸光度時(shí)，使用洗脫緩沖液作為空白。 如果需要從蛋白質(zhì)中去除咪唑，使用脫鹽柱或透析手段。
3.7 手動(dòng)操作
1) 輕輕搖動(dòng)裝有Ni-瓊脂糖凝膠6FF的瓶子，直到介質(zhì)均勻。
2) 從瓶中取出2ml漿液，并轉(zhuǎn)移到離心管中。
3) 3.500×g離心5分鐘沉淀Ni-瓊脂糖凝膠6FF。
4) 棄去上清液，并換成5ml蒸餾水。
5) 輕輕搖動(dòng)Ni-瓊脂糖凝膠6FF，3分鐘，并通過(guò)在500×g離心5分鐘來(lái)分離。
6) 使用結(jié)合緩沖液代替蒸餾水重復(fù)步驟4和5，至少3-5次。
7) 將Ni-瓊脂糖凝膠6FF轉(zhuǎn)移到量筒。
8) 加入適當(dāng)體積的結(jié)合緩沖液以制備50％漿液。
9) 將4ml樣品加入1ml 50％漿液中。Ni-瓊脂糖凝膠6FF的結(jié)合能力是依據(jù)蛋白質(zhì)的性質(zhì)不同而不同的，平均值為20-40mg/ml。這意味著1ml的50％漿液可以結(jié)合大約10-20mg組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)。
10) 將樣品和Ni-瓊脂糖凝膠6FF漿液在室溫下在搖床上低速孵育1小時(shí)。
11) 用2×1ml結(jié)合緩沖液洗滌并收集兩種組分。
12) 用4×0.5ml洗脫緩沖液洗脫，并將洗脫的組分收集在四個(gè)單獨(dú)的管中。
13) 使用分光光度計(jì)測(cè)量280nm處的吸光度，并通過(guò)SDS-PAGE確認(rèn)各組分的純度。使用洗脫緩沖液作為空白。
4. 可能的問(wèn)題
4.1 柱子堵塞
（1）樣品中的細(xì)胞碎片可能堵塞色譜柱。
（2）通過(guò)0.22μm或0.45μm過(guò)濾器離心和/或過(guò)濾樣品。
4.2 洗脫液中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)組氨酸標(biāo)簽蛋白
（1）洗脫條件太溫和（組氨酸標(biāo)記的蛋白質(zhì)仍然結(jié)合）：用增加咪唑的濃度或降低pH洗脫以確定最佳洗脫條件。
（2）樣品或結(jié)合緩沖液中咪唑的濃度太高，影響了his蛋白質(zhì)的結(jié)合，這時(shí)，需要降低樣品或結(jié)合緩沖液中咪唑濃度。
（3）靶蛋白可能不是預(yù)期的組氨酸標(biāo)簽蛋白：驗(yàn)證DNA序列。
（4）組氨酸標(biāo)簽可能未充分暴露，所以沒(méi)有結(jié)合到填料上。
（5）對(duì)于包涵體，在蛋白質(zhì)的變形復(fù)性過(guò)程中，活性喪失。盡量選擇可溶性蛋白進(jìn)行純化。
（6）緩沖液或樣品組成不正確：檢查樣品和結(jié)合緩沖液的pH和組成，確保溶液中螯合劑或強(qiáng)還原劑以及咪唑的濃度不要太高。
4.3 洗脫的蛋白質(zhì)不純
如果雜蛋白對(duì)鎳離子同樣具有高親和力，這時(shí)需要優(yōu)化結(jié)合緩沖液的咪唑濃度，如果優(yōu)化條件除不去雜蛋白，可能需要通過(guò)離子交換層析或凝膠過(guò)濾進(jìn)一步純化。
5 再生
注意：如果要純化相同的蛋白質(zhì)，則不必在每次純化之間去再生，在5-7次純化后再生就足夠了。
為了重新對(duì)Ni-瓊脂糖凝膠6FF掛Ni2+，首先除去殘留的Ni2+：
（1）用20mM磷酸緩沖液，0.5M NaCl，50mM EDTA，pH 7.4，沖洗柱子，洗5個(gè)柱體積，以洗去殘留的Ni2+離子；
（2）用至少5倍柱體積的蒸餾水洗柱子，以徹底清洗掉殘留的EDTA；
（3）用0.1M NiSO4過(guò)柱子，2-5個(gè)柱體積；
（4）用至少5倍柱體積的蒸餾水洗柱子，以徹底清洗沒(méi)有結(jié)合的Ni2+離子；
（5）用20%的乙醇過(guò)柱子，讓填料保存在20%的乙醇環(huán)境中。
6 在位清洗（CIP）
（1）當(dāng)看到背壓增加時(shí)，就應(yīng)該清洗色譜柱，對(duì)柱子重新掛鎳再生。
（2）除去離子交換作用吸附的蛋白，用2~3倍柱床體積2M NaCl溶液淋洗柱子，再反向淋洗，最后用水徹底清洗。
7 保存
使用完的填料，用純水徹底沖洗，最后保存在20%乙醇中，4℃保存。
注意事項(xiàng)：
1.上樣之前，樣品必須經(jīng)過(guò)膜過(guò)濾及去除色素，否則雜質(zhì)及色素會(huì)被吸附到填料上，影響填料的正常使用。
2.在使用過(guò)程中，避免使用高濃度的強(qiáng)酸強(qiáng)堿，酸和堿的濃度應(yīng)低于0.1摩爾。堿會(huì)使流速變慢。
3.不同的樣品，吸附和洗脫方法不相同，可以根據(jù)相關(guān)的文獻(xiàn)進(jìn)行。
