精確檢測CRISPR脫靶效應的新方法

 CRISPR作為新興的基因組編輯技術，雖然優(yōu)勢多多，但是仍然被脫靶效應所困擾。CRISPR技術目前被廣泛應用于研究中，而將來更有望用于臨床，但若要轉化到臨床應用，準確檢測脫靶效應則是必不可少的。近日，麻省總醫(yī)院的研究人員開發(fā)出一種新策略，能夠鑒定全基因組范圍的CRISPR/Cas9脫靶突變。
精確檢測CRISPR脫靶效應的新方法　　　　之前，在全基因組范圍鑒定脫靶效應的細胞方法也時有報道，但這些方法可能錯過低頻率的脫靶突變，而且高效轉染的要求也限制了其應用。相比之下，體外篩查策略則具有一定的優(yōu)勢。它不需要高效轉染，避免了細胞適應性的影響。此外，活性核酸酶的濃度可以盡可能高，將低頻率突變一網打盡?！　　　≡谶@篇周一發(fā)表于《Nature Methods》的文章中，麻省總醫(yī)院和哈佛大學的研究人員介紹了一種新的體外篩查方法CIRCLE-seq。他們認為，這種方法在鑒定全基因組的CRISPR/Cas9脫靶突變上，比現有的細胞或生化方法表現更佳?！　　　?ldquo;與之前的體外方法相比，我們表明CIRCLE-seq可使用廣泛普及的新一代測序技術，且不需要參考基因組序列，”作者在文中寫道。重要的是，這種方法可以鑒定與細胞類型特異的單核苷酸多態(tài)性相關的脫靶突變，證明了它有望生成個性化的特異性圖譜?？傊珻IRCLE-seq為鑒定全基因組范圍的脫靶突變提供了一種快速全面的方法?！　　　≡谶@項研究中，研究人員設計了不依賴限制性內切酶的策略，將隨機剪切的DNA轉化為兩種不同類型的共價閉合DNA結構：將莖環(huán)連接到線性DNA末端，或將線性片段環(huán)化。他們發(fā)現，在富集Cas9核酸酶切割的基因組DNA片段時，環(huán)化策略的效率比連接策略至少高了一個數量級?！　　　‰S后，研究人員檢測了新方法的靈敏度。他們獲得了針對HBB基因的向導RNA的脫靶結果，并將這個圖譜與另一種鑒定方法（Digenome-seq）獲得的圖譜進行比較。他們發(fā)現，CIRCLE-seq鑒定出Digenome-seq所發(fā)現的29個脫靶位點中的26個，同時還發(fā)現了156個新位點。　　　　“這些結果表明，與Digenome-seq相比，CIRCLE-seq具有更高的信噪比，且需要的測序reads少了100倍。在鑒定全基因組的脫靶位點時，它有望實現更高的靈敏度，”作者寫道?！　　　≡谕黄诘碾s志上，Caribou Biosciences和DuPont Pioneer的研究人員介紹了另一種名為SITE-Seq的生化方法，它利用通過向導RNA編程的Cas9來鑒定基因組內的切割位點?！　　　【庉孅c評　　　　IDLV方法并非完美，因為它不能可靠檢測低頻率的脫靶位點，但強調這種方法的無偏向性。這是一個生物學分析；它并非基于哪些可能是脫靶位點的預測。